Như đã biết, máy xét nghiệm sinh hoá sử dụng phương pháp đo màu quang điện, để đo độ hấp thụ của các chất trong bệnh phẩm, người ta không thể đo trực tiếp các chất đó vì bản thân các chất đó trong dung dịch là trong suốt. Mặt khác, trong các dung dịch xét nghiệm có rất nhiều các chất khác nhau nên càng khó khăn trong việc đo đạc và tính toán. Vì vậy, để làm việc với một loại chất cần nghiên cứu trong dung dịch xét nghiệm, người ta sử dụng phương pháp đánh dấu màu. Bằng cách sử dụng tích chất hoá học của các chất cần nghiên cứu, người ta sử dụng chất đó cho tác dụng với một chất hay một số chất nào đó, trong quá trình phản ứng, chất đó sẽ tạo ra một sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng nào đó là mạnh nhất. Sự hấp thụ mạnh hay yếu sẽ tỷ lệ với nồng độ của chất đó trong dung dịch. Từ đó ta có thể tính toán dễ dàng để có được các thông số mong muốn. Nội dung dưới đây sẽ trình bày các nguyên tắc tạo các sản phẩm có tính chất hấp thụ trên để đo một số thông số xét nghiệm điển hình.
3.1. Creatinin (CRE)
Việc tạo màu để đo được Cre theo các phản ứng sau:
Trong đó TOOS là N-Ethyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)m-Toluidine
Pq là chất có màu đỏ, vì vậy khi đo cần bước sóng 555nm
3.2. Protein toàn phần (PRO)
Dung dịch Cu++ là dùng dịch kiềm phản ứng với chuỗi peptide của protein tạo thành phức polipeptide có màu tím. Đo sự hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 540nm sẽ cho ta nồng độ của protein trong dung dịch
Phương trình phản ứng:
3.3. Urê
Amoni và CO2 được tạo ra khi urê bị thuỷ phân với xúc tác là urease. Ion amoni tạo ra kết hợp với 2-Oxoglutarate và NADH với xúc tác Glutamate đihydro ( GLDH) tạo thành Glutamate và NAD+, phản ứng NADH/NAD tạo ra sự thay đổi tuyến tính về sự hấp thụ ở bước sóng 340nm, nó tỷ lệ với nồng độ urê trong dung dịch.
Phương trình phản ứng:
3.4. Cholesterol (CHO)
Phản ứng tạo màu của cholesterol theo các phản ứng sau:
Rq là dung dịch đỏ, được đo ở bước sóng 492 đến 550nm
3.5. Glucose (GLU)
Phản ứng tạo màu của glucose như sau:
Rq là dung dịch đỏ, được đo ở bước sóng 492 đến 550nm, tốt nhất là ở 500nm.
3.6. Bilirubil toàn phần
Axít Sulfanic phản ứng với natri nitơrit để tạo axít diazotized sulfanilic. Axít này phản ứng với bilirubil toàn phần với chất xúc tác dimethylsulfoxide tạo thành azobilirubil, dung dịch này đo ở bước sóng 540 đến 560 nm, tốt nhất ở 555nm.
3.7. Amylase
Trong phản ứng, amylase đóng vai trò xúc tác. Tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ amylase có trong dung dịch, sản phẩm tạo ra hấp thụ mạnh ở bước sóng 400-420nm, tốt nhất tại 405nm.
Phương trình phản ứng:
3.8. Creatininkinase (CK)
Phương trình phản ứng của Creatine phosphate như sau:
HK: hexokinase
ATP: Adenosine tri-Phosphate
G-6-PDH: Glucose-6-Phosphate dehydrogense
NAPD: Nicotinamide adenine denucleotide phosphate
Phản ứng cho NADPH và G-6-P có tốc độ tăng sự hấp thụ ở dải bước sóng 340nm (334-365nm) cho ta độ hoạt động của CK trong mẫu.
3.9. Lactat dehydrogenase ( LDH)
Đo sự hoạt động của LDH theo phản ứng sau:
Đo LDH dựa vào tốc độ phản ứng trên, LDH đóng vai trò xúc tác, phản ánh qua sự hấp thụ ở bước sóng 334-365nm.
3.10. Phosphate
Axít phosphate (ACP):
Sự có mặt của axít phosphate trong huyết thanh sẽ phân huỷ a-naphthyl phosphate thành a-naphthol và phosphate vô cơ. a-naphthol tiếp tục phân huỷ dưới xúc tác Fast red TR cho dung dịch màu vàng đậm dần lên. Đo sự thay đổi của dung dịch này tại bước sóng 405nm cho ta hoạt tính của axít này.
Phosphate kiềm ( ALP):
ALP có trong dung dịch thuỷ phân p-Nitrophenylphosphate (PNPP), trong quá trình giải phóng p-nitrophenol và phosphate, sự tăng hấp thụ ở bước sóng 405nm sẽ cho chúng ta biết hoạt động của ALP trong dung dịch.
Phương trình phản ứng thuỷ phân như sau:
MDH là Malate dehyđo, AST đóng vai trò xúc tác phản ứng tạo oxaloacetate, phản ứng oxaloacetate tạo NAD hấp thụ ở bước sóng 340 cho ta sự hoạt động của AST.
ALT (GOT):
ALT đóng vai trò xúc tác cho phản ứng tạo pyruvate:
3.12. Triglycerides ( PAP)
Triglycerides trong dung dịch bị thuỷ phân dưới xúc tác lipoprotein lipase (LPL) thành Glycerol và axit béo. Glycerol tác dụng với ATP với xúc tác Glycerol Kinase (GK) tạo ra glycerol-3-Phosphate G-3-P, G-3-P bị oxi hoá, dung dịch có màu đỏ nhẹ hấp thụ tốt ở bước sóng 505 (490-550nm).
3.13. Axit Uric
Uricase chuyển axit uric có trong dung dịch thành allantoin, carbon dioxide CO2 và hydrogen peroxide H2O2. Dưới xúc tác của POD, Phenol derivative, 3,5-Dichloro-2-Hidroxy-benzenesulfonic axít (DHBS) và 4-Aminoantipyrine, H2O2 cho một dung dịch màu đỏ nhẹ có thể đo ở bước sóng 520nm, việc tăng hấp thụ tương ứng với nồng độ uric có trong dung dịch.
Phương trình phản ứng:
