Công ty TNHH Sao Đỏ Việt Nam

Thu ảnh thời gian sống huỳnh quang (FLIM) là kỹ thuật thu ảnh dựa trên sự khác biệt về tốc độ phân rã trạng thái kích thích của mẫu. Bởi vậy, FLIM là một kỹ thuật thu ảnh huỳnh quang có độ tương phản dựa trên thời gian sống của các fluorophore đơn lẻ hơn là dựa vào tín hiệu phổ phát xạ. Thời gian sống huỳnh quang được xác định là thời gian trung bình mà một phân tử tồn tại trong trạng thái kích thích trước khi trở lại trạng thái cơ bản.

Vì thời gian sống huỳnh quang không phụ thuộc vào nồng độ, độ hấp thụ của mẫu, bề dày mẫu, cường độ kích thích và/hoặc tẩy mầu bằng ánh sáng, do đo FLIM là phương pháp hiệu quả hơn các phương pháp dựa vào cường độ. Đồng thời, thời gian sống huỳnh quang phụ thuộc vào các điều kiện môi trường như độ pH, i-ôn hoặc nồng độ ô-xy, liên kết phân tử hoặc trang thái của phân tử nhận năng lượng nên đã tạo ra một phương pháp thu ảnh chức năng đa dạng.

Kỹ thuật thu ảnh thời gian sống lân quang (PLIM) tương tự như kỹ thuật thu ảnh thời gian sống huỳnh quang (FLIM), kỹ thuật này thu tín hiệu lân quang từ mẫu với tốc độ đến mili-giây. Tương tự như kỹ thuật FLIM, độ tương phản của ảnh PLIM phụ thuộc vào thời gian sống của các fluorophore đơn lẻ hơn là phụ thuộc vào tín hiệu phổ phát xạ. Thời gian sống lân quang được xác định là thời gian trung bình mà một phân tử tồn tại trong trạng thái kích thích trước khi quay trở lại trạng thái cơ bản.

PLIM, hay nói chung là kỹ thuật xác định đặc tính hợp chất lân quang đã đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực khoa học vật liệu trong một thời gian dài, thu hút được sự quan tâm của giới nghiên cứu trong thập kỷ vừa qua với sự bùng nổ của công nghệ điốt phát quang hữu cơ (OLED). Các loại mẫu tiêu biểu thường được nghiên cứu bằng kỹ thuật này gồm i-ôn kim loại phức hợp với các phối tử hữu cơ được sử dụng để ghi lại quá trình tiệu thụ ô-xy trong các tế bào sống.

Kích thích xung đan xen (PIE) là kỹ thuật đồng bộ hóa một vài nguồn laze. Xung laze được tách riêng trên một thang thời gian nano-giây để quan sát đồng thời sự biến đổi đặc tính theo thời gian của phân tử khi được kích thích bởi các nguồn laze khác nhau. Trong phương pháp này thì thường hai nguồn laze với bước song phù hợp được lựa chọn để kích thích lần lượt hai chất huỳnh quang. Xung laze được phát lần lượt để tạo ra chuỗi xung đan xen. Để trách việc phát xúc cùng lúc, tốc độ lặp lại của nguồn laze được điều chỉnh để huỳnh quang của mỗi chất nhuộm phân rã hoàn toàn trước khi kích thích chất tiếp theo.

PIE thường được sử dụng kế hợp với kỹ thuật truyền năng lượng cộng hưởng Foerster cặp đơn (spFRET), ở đó donor và acceptor được kích thích luân phiên. Bằng cách này chất  huỳnh quang của acceptor được kích thích độc lập với quá trình FRET để chứng tỏ sự tồn tại và quang hoạt của nó. Phân tử mà thiếu donor hoặc acceptor hoạt động được tách rời khỏi phức hệ FRET. Quá trình này cho phép phân biệt được phân tử FRET với một phân tử thiếu hoặc không phát quang.

Phổ tương quan huỳnh quang kết hợp kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian được gọi là phổ tương quan thời gian huỳnh quang (FLCS), đây là một phương pháp sử dụng kỹ thuật thu tín hiệu huỳnh quang phân giải thời gian pico-giây để tách biệt các FCS-contributions. Kỹ thuật FLCS đặc biệt hữu ích khi sử dụng các chất huỳnh quang có thời gian sống khác nhau do loại bỏ được hiện tượng trùng nền và nhiễu phổ. Trong kỹ thuật FLCS, chức năng phân tích tương quan tự động được tính toán cho mỗi phân tử huỳnh quang dựa trên hình thái phân rã. Cốt lõi của phương pháp này là quá trinh phân tách các dao động cường độ khác nhau mà có thời gian sống tương tự trên một đơn photon.

Để phân tích định lượng trên một thí nghiệm FCS thì cần phải biết chính xác hình thái và kích thước dung tích đồng tiêu. Tuy nhiên lại có khó khăn là dung tích đồng tiêu phụ thuộc vào rất nhiều thông số quang học, ghép đôi không xứng hệ số chiết suất của dung dịch hòa tan mẫu và dầu nhúng vật kính, độ dày khác nhau của tấm đậy lam kính và độ bão hòa quang của chất nhuộm huỳnh quang.

Khác với kỹ thuật FCS truyền thống, 2fFCS là kỹ thuật loại bỏ được nhiễu tạp, do đó cho phép đo được hệ số khuếch tán tuyệt đối. Kỹ thuật 2fFCS sử dụng khoảng cách giữa hai thể tích đồng tiêu đề làm tham chiếu thay vì dựa vào kích thước và hình dạng của chúng.

Các phép đo dị hướng huỳnh quang phân giải thời gian trạng thái tĩnh cho phép xác định được định hướng và chuyển động phân tử cũng như các quá trình tác động lên các phân tử. Ngoại trừ những trường hợp đặc biệt, dị hướng không phụ thuộc vào nồng độ của chất huỳnh quang mà phụ thuộc vào cường độ tín hiệu thu được. Do sự tương đồng với đặc tính thời gian sống huỳnh quang nên có thể coi dị hướng là một khía cạnh thông tin huỳnh quang thu được khác.

Phân tử với mômen chuyển tiếp hấp thụ (ATM) thẳng hàng với mặt phẳng phân cực của tiến trình kích thích sẽ được kích thích trước tiên. Quá trình này được gọi là “photo-selection”, lý dò là các phân tử với ATM năm vuông góc với bề mặt phân cực kích thích sẽ khong được kích thích cùng lúc, những phân tử này sẽ duy trì trạng thái cơ bản của chúng.

Nguồn laze xung giúp có thể thao tác xử lý các cấu trúc mẫu nằm trong mô và tế bào, thậm chí ở cấp độ phân tử hay can thiệp vào quá trình hình thành tế bào. Khi sử dụng nguồn laze để cắt các cấu trúc tế bào như vi cấu trúc hình ống hay loại bỏ toàn bộ tế bào cho phép nghiên cứu lĩnh vực sinh học phát triển và tế bào học. Kỹ thuật này cung cấp cái nhìn mới về cấu trúc thoi vô sắc, phân ly nhiễm sắc hay vận động tế bào. Bên cạnh đó, kỹ thuật này được sử dụng để kích hoạt gen hay cung cấp những thông tin mới về nguồn gốc, chủng loại rồi chức năng của từng tế bào trên sinh vật đang phát triển.

Cắt và ăn mòn mẫu bằng laze là phương pháp rất linh hoạt để thao tác tại bất kỳ vị trí, khuôn mẫu hay thời điểm nào trên cấu trúc mô và tế bào sống, đây được coi là lợi thế căn bản nhất. Kỹ thuật này đạt đến độ phân giải sub-micron, cho phép thao tác trên từng vi cơ quan tế bào. Mức độ ăn mòn hiệu quả phụ thuộc vào nhãn tế bào. Để ăn mòn được hiệu quả thì cần có nguồn laze xung kích thích có tần số cao và công suất trung bình. Điều này giúp tối thiểu hóa nguy cơ phá hủy mẫu. Ngoài ra, mức độ ra nhiệt cũng được giảm tối đa do chiều dài xung ngắn. Do vây, khi sử dụng nguồn laze xung, thời gian phát sáng để ăn mòn rất ngắn và không gây phá hỏng mẫu.