Hệ quang học Greenough và Cycloptic®
Các kính hiển vi hai mắt thế hệ cũ được trang bị một hệ thống thấu kính đơn giản với thiết kế gần giống với các kính hiển vi phức hợp truyền thống. Chúng được biết đến sau đó như những kính hiển vi giải phẫu, được sử dụng chủ yếu trong sinh học cho mục đích bóc tách các lớp biểu mô; và không có bất kỳ ứng dụng kỹ thuật nào tại thời điểm đó. Khoảng năm 1890, nhà sinh vật học và nhà động vật học Horatio S. Greenough người Mỹ đã giới thiệu một nguyên lý thiết kế mới cho hệ thống quang học sử dụng với kính hiển vi hai mắt và vẫn được sử dụng đến tận ngày hôm nay bởi hầu hết các hãng sản xuất. Các kính hiển vi sử dụng thiết kế Greenough (mang tên ông) có 2 hệ thống quang học tách rời cho mắt trái và mắt phải giúp tạo ra hình ảnh lập thể 3D đích thực với chất lượng rất cao.
Năm 1957, một công ty quang học ở Mỹ giới thiệu mẫu thiết kế kính hiển vi soi nổi hiện đại mới với hệ thống quang học mang tên Cycloptic® sử dụng chung một vật kính cho cả hai đường truyền quang học (hệ thống Greenough cũ sử dụng 2 vật kính). Thân kính với hộp đựng bằng nhôm của nó chứa hai đường truyền quang học song song nhưng sử sụng chung một vật kính, đồng thời có thêm một bộ điều chỉnh thay đổi hệ số phóng đại 5 cấp. Dòng kính hiển vi soi nổi này, sử dụng nguyên lý của kính thiên văn và hệ thống CMO (Common Main Objective – Chung vật kính), đã được phát hành rộng rãi cùng với các loại sử dụng hệ thống quan học Greenough trước đây, bởi tất cả các hãng sản xuất kính hiển vi và được sử dụng cho các mô-đun, hoặc thiết bị hiệu năng cao. Hai năm sau, một công ty khác ở mỹ Mỹ - Bausch & Lomb, cho ra mắt thiết kế StereoZoom®Greenough với phát minh mang tính đột phá: Hệ thống điều chỉnh độ phóng đại vô cấp (loại Cycloptic chỉ có 5 cấp).
Tổng kết lại: trong lịch sử phát phát triển hệ thống quang học của kính hiển vi soi nổi ta có 3 loại chính như sau:
Greenough: Loại thông thường với 2 hệ thống quan học tách biệt hoàn toàn (với 2 vật kính) cho phép dẫn 2 chùm sáng từ mẫu vật đến mắt theo 2 hướng lệch nhau một chút tạo ra hiệu ứng ảnh nổi 3D – Nhưng không thay đổi được độ phóng đại. Nếu các bạn để ý thì các kính loại này ống kính 2 mắt sẽ hợp với nhau một góc chữ V thay vì song song như các kính hiển vi 2 mắt thông thường.
Cycloptic®: 2 hệ thống quang học tách biệt song song nhưng sử dụng chung một vật kính – Bộ điều chỉnh hệ số phóng đại 5 cấp.
StereoZoom®Greenough: Bộ điều chỉnh hệ số phóng đại vô cấp (thay đổi độ phóng đại một cách liên tục, không bị giới hạn và giật cấp như Cycloptic)
Còn tính đến thời điểm hiện tại thì hầu như tất cả các thiết kế hiện nay đều sử dụng hệ thống zoom để điều chỉnh độ phóng đại.
Hình. 1 (trái): Kính hiển vi soi nổi hiện đại Cycloptic® đầu tiên sử dụng nguyên lý của kính thiên văn.
Hình. 2a, b (phải): 2 nguyên lý quang học cơ bản của kính hiển vi soi nổi. a: nguyên lý CMO hay kính thiên văn b: nguyên lý Greenough.
Tất cả các kính hiển vi soi nổi ngày nay vẫn dựa trên các hệ thống nguyên lý quang học nêu trên. Vậy những yếu tố khác cần quan tâm là gì? Có 4 vấn đề sau bạn cần chú ý:
a) Ứng dụng của bạn là gì?
b) Cấu trúc gì sẽ được quan sát, chụp ảnh hay chỉ quan sát bằng mắt thường?
c) Có bao nhiêu người cùng sử dụng với bạn?
d) Bạn có bao nhiêu tiền?
Khi đã trả lời được các câu hỏi đó sẽ giúp bạn xác định được các thông số dưới đây cho cấu hình của bạn.
1. Độ phóng đại, dải điều chỉnh zoom và độ rộng trường quan sát
2. Độ sâu trường quan sát và khẩu độ số
3. Chất lượng quang học và khoảng cách làm việc
4. Thiết kế Ergonomics
5. Hệ chiếu sáng
Độ phóng đại tổng cộng của một kính hiển vi soi nổi là sự kết hợp giữa độ phóng đại của bộ điều chỉnh zoom, và độ phóng đại của vật kính, thị kính.
Bộ điều chỉnh độ phóng đại hoặc ống kính zoom
Giống như một ống kính zoom của các máy ảnh chuyên nghiệp, bộ điều chỉnh thay đổi của độ phóng đại của kính hiển vi bao gồm các thấu kính quang học được ghép với nhau có có thể điều chỉnh để thay đổi độ tiêu cự, từ đó thay đổi độ phóng đại của chúng. Bằng cách điều chỉnh thay đổi khoảng cách giữa các thấu kính trong ống kính zoom sẽ giúp thay đổi cấp phóng đại của ống kính. Hệ thống zoom trong các kính hiển soi nổi hiện đại có thể cung cấp hệ số phóng đại lên đến 16x (zoom chỉ cơ thể) với dải zoom 20,5: 1 và kết hợp tính năng tự động hoặc mã hóa để cho kết quả đo lường tin cậy chính xác và lặp lại cao.
Sau khi đi qua ống kính zoom, các hình ảnh được phóng đại thêm một lần nữa bởi các thị kính. Do đó, để tìm ra sự phóng đại của đối tượng mình đang quan sát, ta sẽ lấy tích độ phóng đại của thị kính và hệ số phóng đại đang cài cho hệ thống zoom.
Với trường hợp tổng quát, ta có công thức tính độ phóng đại tổng cộng:
MTOT VIS Là độ phóng đại tổng cộng. VIS viết tắt của "visual" với trường hợp quan sát bằng mắt thường (nếu quan sát bằng camera và màn hình thì công thức trên sẽ phải thêm vào các thừa sổ bổ chính khác).
z là hệ số phóng đại đã lựa chọn trên ống kính zoom (bộ điều chỉnh độ phóng đại).
ME là độ phóng đại của thị kính.
MO là độ phóng đại của vật kính (1x trong trường hợp không sử dụng thêm thấu kính phụ với hệ quang học Greenough System)
Độ rộng trường quan sát
Khi nhìn vào thị kính, sau khi điều chỉnh khoảng cách thích hợp từ mắt đến thị kính và khoảng cách giữa 2 ống kính được thiết lập một cách chính xác, một khu vực hình tròn hiện ra được gọi là trường quan sát (là phạm vi quan sát được trên bề mặt mẫu của kính hiển vi). Đường kính của trường quan sát sẽ thay đổi tùy thuộc vào độ phóng đại. Nói cách khác, tồn tại một mối quan hệ toán học giữa các độ phóng đại và đường kính trường quan sát. Ví dụ: với thị kính 10x hệ số trường 23 - Điều đó có nghĩa khi sử dụng với ống kính zoom và vật kính 1x độ rộng trường quan sát sẽ là 23 mm. Khi điều chỉnh độ phóng đại của ống kính zoom lên 3x độ rộng trường quan sát sẽ giảm một phần ba, đường kính chỉ trường quan sát khi đó chỉ còn 7,66 mm.
Trong kỹ thuật hiển vi, độ sâu của trường thường được coi là một tham số thực nghiệm. Về mặt lý thuyết nó có thể xác định bằng tương quan giữa số khẩu độ, độ phân giải và độ phóng đại. Độ sâu trường quan sát có quan hệ tỷ lệ nghịch với độ phóng đại và độ phân giải. Để thu được hình ảnh với độ diễn tả tốt nhất, các cơ chế điều chỉnh trong kính hiển vi hiện đại sẽ cho phép lựa chọn cân bằng giữa độ sâu trường quan sát và độ phân giải.
Giá trị thực nghiệm của độ sâu trường quan sát
Max Berek, là người đầu tiên công bố các kết quả nghiên cứu bằng thực nghiệm liên quan đến độ sâu trường ảnh với các thí nghiệm phong phú của mình năm 1927. Công thức tính độ sâu trường quan sát của Berek có giá trị thiết thực vẫn được sử dụng cho đến ngày hôm nay.
Ở dạng thức đơn giản, nó được mô tả như sau:
TVIS: Chiều sâu trường ảnh khi quan sát bằng mắt thường (Không áp dụng cho trường hợp sử dụng Camera)
n: Chiết suất của môi trường.
λ: Bước sóng ánh sáng sử dụng, với ánh sáng trắng λ = 0.55 μm
NA: Khẩu độ số của vật kính
MTOT VIS: Độ phóng đại tổng cộng của kính hiển vi
Nếu trong công thức trên giá trị độ phóng đại tổng cộng được thay bằng giá trị độ phóng đại hữu ích (MTOT VIS = 500 to 1,000 x NA), thì có thể thấy rằng, trong xấp xỉ bậc nhất, độ sâu của trường quan sát tỷ lệ nghịch với lũy thừa bậc 2 của khẩu độ số.
Fig. 3: Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của độ sâu trường quan sát như một hàm của khẩu độ số NA với bươc sóng λ = 0.55 mm và chiết suất n = 1
Đặc biệt ở độ phóng đại thấp, độ sâu của trường tăng lên rõ rệt khi giảm khẩu độ số. Điều này có thể thực hiện một cách dễ dàng bằng cách giảm độ mở của ống kính sử dụng một màng chắn khẩu độ dạng con ngươi. Tuy nhiên, việc giảm khẩu độ số sẽ dẫn đến giảm độ phân giải.
Do đó, vấn đề đặt ra là cần phải điều chỉnh sao cho tối ưu để cân bằng bằng giữa độ phân giải và độ sâu trường ảnh tùy thuộc vào từng đối tượng cụ thể. Trong trường hợp của kính hiển vi soi nổi độ sâu trường quan sát sẽ được lựa chọn ưu tiên, để đáp ứng được yêu cầu quan sát ảnh lập thể 3D.
Fig. 4: Tiêu diện vật của kính hiển vi soi nổi sử dụng hệ quang học Greenough với độ sâu trường quan sát
Độ sâu trường quan sát tối đa – Hệ quang điều chỉnh FusionOpticsTM
Như ngay phần đầu tiên của bài viết này, ta biết rằng kính hiển vi soi nổi có 2 hệ thống dẫn sáng quang học cho hai mắt riêng biệt. Lợi dụng đặc điểm này kết hợp với đặc tính sinh học của mắt người sẽ giúp ta vượt qua được giới hạn trong mối quan hệ giữa độ phân giải và độ sâu trường quan sát nhờ sáng kiến về hệ quang điều chỉnh FusionOptics ™. Trong đó, người ta thiết kế hệ quang với 2 đường truyền sáng cho mắt trái và mắt phải khác nhau một chút, để mắt trái sẽ thu được hình ảnh với độ phân giải cao và độ sâu trường quan sát nhỏ còn mắt phải ngược lại sẽ thu được hình ảnh với độ phân giải thấp và độ sâu trường quan sát tối đa. Hình ảnh cuối cùng thu được trong bộ não người sẽ là sự kết hợp của hai hình ảnh thu được từ 2 mắt và có độ phân giải và độ sâu trường quan sát tối đa.
Fig. 5: Kính hiển vi soi nổi hiện đại trang bị hệ thống Zoom 20.5:1 với thệ thống quang học APO và FusionOptics™.
Chất lượng quang học
Chất lượng quang học của một hệ thống kính hiển vi soi nổi phụ thuộc vào việc hiệu chỉnh sắc sai, cầu sai và hiện tượng cong trường quan sát.
Về mức độ hiệu chỉnh sắc sai và cầu sai hệ thống quang học được chia làm hai loại: loại Achro hoặc Achromat (tiêu sắc), và loại Apo (tiêu sắc apochromatic) tùy thuộc vào mức độ hiệu chỉnh sắc sai và cầu sai của các thấu kính.
Về hiệu ứng cong trường: Ta có hệ thống quang học thông thường và Hệ thống quang học có hiệu chỉnh cong trường quan sát được ký hiệu là Plan.
Một hệ thống kết hợp hiệu chỉnh đồng thời sắc sai, cầu sai và cong trường được ký hiệu là PlanApo.
Ví dụ: Hãng sản xuất kính hiển vi hàng đầu thế giới Leica cung cấp 3 thống quang học dưới đây cho kính hiển vi soi nổi.
|
Achro, Achromat |
Hệ thống tiêu sắc (được hiệu chỉnh sắc sai và cầu sai) |
|
Plan |
Hệ thống trường phẳng (được hiệu chỉnh hiện tượng cong trường quan sát) |
|
PlanApo |
Hệ thống phẳng tiêu sắc |
Sắc sai là gì?
Khi sử dụng các dụng cụ quang học như kính hiển vi soi nổi, sắc sai là là một dạng khiếm khuyết, trong đó hệ thấu kính thất bại trong việc cố gắng tập trung tất cả các tia sáng có màu sắc khác nhau trong một chùm sáng vào một điểm duy nhất. Nguyên nhân do vật liệu chế tạo thấu kính có chiết suất thay đổi phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng. Chiết suất của thấu kính lớn hơn với với các bước sóng ngắn và nhỏ hơn với các bước sóng dài. Điều này dẫn đến các tia sáng có bước sóng ngắn hội tụ tại một tiêu điểm gần thấu kính hơn so với các tia sáng có bước sóng dài. Một hệ thống quang học tốt cần được thiết kế để giảm thiểu hoặc loại bỏ gần như hoàn toàn hiện tượng sắc sai này.
Các loại thấu kính tiêu sắc đã được nghiên cứu và phát triển. Chúng được thiết kế để hạn chế ảnh hưởng của sắc sai và cầu sai lên chất lượng hình ảnh. Các thấu kính tiêu sắc thông thường được hiệu chỉnh cho phép hai bước sóng khác nhau (thường là màu đỏ và màu xanh) hội tụ về cùng một điểm. Các thấu kính tiêu sắc này được sử dụng trong các ứng dụng để tái tạo lại các đặc trưng hình học là chủ yếu, không yêu cầu nhiều về vấn đề tái tạo trung thực màu sắc. Các thấu kính tiêu sắc cao cấp Apochromatic được thiết kế để có thể chỉnh sửa ba bước sóng (màu đỏ, xanh lá cây, và màu xanh) cùng hội tụ về một điểm.
Khoảng cách làm việc
Khoảng cách làm việc là khoảng cách tính từ mặt trước của vật kính tới bề mặt quan sát sau khi điều chỉnh hội tụ vào bề mặt mẫu quan sát. Trong hầu hết mọi trường hợp khoảng cách làm việc sẽ giảm khi độ phóng đại tăng (ngoại trừ các kính hiển vi sử dụng hệ quang học vô tiêu). Trong kính hiển vi soi nổi, khoảng cách làm việc là một thông số quan trọng tiêu chuẩn, vì nó quyết định trực tiếp đến khả năng sử dụng của kính hiển vi. Nếu khoảng cách làm việc quá nhỏ, vật cần quan sát sẽ phải đặt sát vào vật kính, làm hạn chế đáng kể khả năng thao tác với mẫu, và ảnh hưởng đến năng suất công việc.
Fig. 6: Ergo tube – Relaxed body and head, arms comfortably supported, adequate space for the legs, good use of the chair.
Trong các thao tác hàng ngày với kính hiển vi, có người cao, có người thấp, việc này có thể gây ra các bất tiện, sự không thoải mái căng thẳng cho người vận hành. Ví dụ nếu góc quan sát của ống kính quá thấp, một số người sử dụng sẽ có xu hướng phải đổ người về phía trước khi vận hành, dẫn đến căng thẳng các cơ ở vùng cổ. Vì vậy thật lý tưởng nếu ta có thể điều chỉnh được góc nghiêng của ống thị kính phù hợp với vóc dáng của người sử dụng. Thêm vào đó khả năng điều chỉnh góc quan sát của ống kính cũng giúp người sử dụng không cần thay đổi tư thế nhiều khi làm việc, giúp cho người quan sát thoải mái với tư thế ngồi của bản thân.
Nhờ thiết kế dạng mô-đun các kính hiển vi soi nổi hệ quang học CMO cho phép có nhiều tùy chọn để phù hợp với vóc dáng cũng như thói quen của người sử dụng sẽ là một giải pháp hoàn hảo trong trường hợp này.
Trong kính hiển vi soi nổi, hệ thống chiếu sáng là yếu tố chìa khóa đem tất cả công việc phơi bày ra ánh sáng. Sự chiếu sáng đúng sẽ làm nổi bật các cấu trúc cần quan sát hoặc làm bộc lộ thêm các thông tin khác về mẫu, chỉ bằng cách thay đổi các phương pháp chiếu sáng khác nhau. Điều quan trọng là sự chiếu sáng phải phù hợp với kính hiển vi sử dụng và ứng dụng cụ thể.
Fig. 7: Hệ thống chiếu sáng của kính hiển vi soi nổi hiện đại thường sử dụng đèn LED tuổi thọ cao
Các kỹ thuật chiếu sáng
Ánh sáng tới
Kỹ thuật quan sát với ánh sáng chiếu tới thường được sử dụng với các mẫu không trong suốt. Có một số loại nguồn sáng khác nhau có thể được sử dụng như nguồn sáng điểm, nguồn sáng vòng…tùy thuộc vào kết cấu của mẫu và ứng dụng khác nhau.
Nguồn sáng truyền qua
Kỹ thuật quan sát sử dụng ánh sáng truyền qua có thể áp dụng cho rất nhiều loại mẫu trong suốt khác như từ mẫu sinh học như các cơ thể sinh vật cho đến các mẫu polime.
Chiếu sáng trường sáng truyền qua
Kỹ thuật chiếu sáng trường sáng truyền qua được áp dụng cho tất cả các loại mẫu trong suốt với độ tương phản cao và đầy đủ tông tin về màu sắc.
Ánh sáng truyền qua theo phương xiên góc
Kỹ thuật chiếu sáng này được áp dụng cho các mẫu không màu bán trong suốt. Chùm sáng tới được thiết kế chiếu nghiêng một góc sẽ cho phép thu được độ tương phản cao hơn và hình ảnh rõ hơn của mẫu vật có thể thu được.
Chiếu sáng trường tối
Kỹ thuật quan sát trường tối trong kính hiển vi soi nổi yêu cầu thân kính thiết kế đặc biệt với gương phản xạ và tấm chắn sáng để chặn bớt một phần chùm tia tạo ra một hình nón rỗng chiếu vào mẫu vật theo phương nghiêng. Nguyên lý chiếu sáng trường tối với kính hiển vi soi nổi cũng hoàn toàn giống với các kính hiển phức hợp thông thường, trong đó thường sử dụng hệ thống tụ quang phức hợp với nhiều thấu kính hoặc tụ quang có gương tích hợp đặc biệt với bề mặt phản xạ định hướng theo các góc hình học nhất định.
Kỹ thuật tương phản cho các mẫu trong suốt, truyền qua
Kỹ thuật chiếu sáng Rottermann Contrast ™: Đây là một kỹ thuật chiếu sáng một phần cho phép biểu diễn sự thay đổi của chiết suất thành sự khác biệt về độ sáng trên ảnh. Sự phân bố pha của vật liệu sẽ được biểu diễn lại trong không gian. Kỹ thuật này cung cấp nhiều cái nhìn khác nhau để mang lại tối đa thông tin có thể từ mẫu.
Việc tìm hiểu kỹ các yêu cầu về ứng dụng cho kính hiển vi soi nổi là yếu tố then chốt mang lại cho sự hài lòng cho người dụng lâu dài. Vì nó là một trong những công cụ then chốt của phòng thí nghiệm hoặc bộ phận sản xuất, các nhà hoạch định cần phải đảm bảo rằng họ có thể điều chỉnh công cụ của mình để đáp ứng 100% yêu cầu của người dùng. Điều này đòi hỏi các nhà cung cấp giải pháp hiển vi cần tư vấn và đáp ứng được mọi yêu cầu đặt ra của người sử dụng.
