Công ty TNHH Sao Đỏ Việt Nam

Icons giỏ hàng Giỏ hàng 0
Tổng : 0 đ
Trang chủ  /  Tin tức  /  Góc kiến thức

Tách mẫu kết đông (Freeze Fracture) và Ăn mòn kết đông (Freeze Etching)

1.245 lượt - 07-07-2016, 4:06 pm

Tách mẫu kết đông là kỹ thuật bẻ đôi mẫu được đông kết để quan sát cấu trúc bên trong. Ăn mòn kết đông là kỹ thuật làm thăng hoa nước đóng băng trên bề mặt ở môi trường chân không, qua đó giúp quan sát các chi tiết trên bề mặt ẩn phía dưới. Quá trình ăn mòn kim loại kết hợp cacbon giúp mẫu có thể quan sát được với kính hiển vi điện tử quét (SEM) (mặt cắt) hoặc kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (bản sao). Kỹ thuật chuẩn bị mẫu này được sử dụng để quan sát và phân tích cơ quan tế bào, lớp màng, lớp cắt, nhũ tương. Kỹ thuật này thường được sử dụng cho ứng dụng sinh học, tuy nhiên ngay nay cũng bắt đầu được áp dụng cho ngành vật lý và khoa học vật liệu. Gần đây, hiển vi điện tử tách mẫu kết đông, đặc biệt kỹ thuật đánh dấu miễn dịch bản sao kết đông (FRIL) đã đem lại những phát hiện mới về vai trò của protein màng trong quá trình phát triển tế bào động.

 

Hình 1: Rệp cây trên lá lúa mỳ

 

Phù hợp với môi trường của kính hiển vi điện tử

Buồng mẫu của hiển vi điện tử được hút chân không xuống mức áp suất rất thấp. Cấu trúc tế bào sống trong môi trường này sẽ khổng thể duy trì do quá trình bốc hơi nước cực nhanh, trong khi nước là phần tử chính của tế bào.

 

Có một số kỹ thuật chuẩn bị mẫu sinh học. Mẫu được cố định để quá trình khử nước chỉ gây ra những tác động tối thiểu tới cấu trúc cơ thể sống, trong trường hợp này thì loại kính hiển vi điện tử quét môi trường (environmental SEM) có thể được sử dụng hoặc phân tử nước có thể được đông kết. Đông kết áp suất cao là cách duy nhất để có thể quan sát cấu trúc thủy hóa trong điều kiện tự nhiên của chúng. Nước đóng băng được hình thành bởi quá trình kết đông công suất cao không phải là loại nước đóng băng có sáu cạnh, quá trình này cho thấy sự gia tăng về thể tích khi chuyển hóa từ nước thành nước đóng băng, loại nước đóng băng vô định hình, tại đây thể tích được duy trì liên tục. Kết quả là, cấu trúc nhạy cảm với nhiệt độ và độ thẩm thấu sẽ được duy trì nguyên trạng (xem tài liệu “Kết đông áp suất cao”).

 

Để quan sát các cấu trúc như cơ quan tế bào, thể màng, nhũ tương hoặc liên kết bề mặt của chất lỏng thì tách mẫu kết đông là cánh duy nhất có thể thực hiện được nhiệm vụ này. Mẫu kết đông được tách/bẻ gẫy ở phần yếu nhất bằng một lực được tạo ra bởi dao cắt hay bằng một lực tải lò xò.

 

 

Thăng hóa và lắng đọng nước – Ăn mòn kết đông và nhiễm bẩn

Để có thể tiết lộ được chi tiết bề mặt mẫu được tách thì nước đóng băng phải được loại bỏ. Quá trình này có thể thực hiện bằng kỹ thuật thăng hoa nước đóng băng để duy trì cấu trúc mẫu. Nước đóng băng được chuyển đổi trực tiếp thành hơi nước mà không trải qua quá trình hình thành chất lỏng, quá trình hình thành chất lỏng sẽ gây ra biến đối về khối lượng và phá hủy cấu trúc mẫu.

 

Hình 3: Bề mặt ngoại chất; PP, bề mặt huyết tương; EF, bề mặt tách huyết tương ngoại chất; PS, bề mặt huyết tương; Cyt, bề mặt bào tương

 

Quá trình thăng hoa/cô đọng của nước phụ thuộc vào áp suất bão hòa tại mức nhiệt độ cụ thể và áp suất cục bộ hiệu quả của nước hoặc nước đóng băng trong buồng mẫu. Ghi chú: môi trường chân không sạch sẽ làm giảm mức áp suất cục bộ.

 

Ví dụ: Nước đóng băng hoặc mẫu đóng băng ở nhiệt độ -120oC có áp suất bão hòa khoảng 10-7 mbar. Nếu mức áp suất này được thiết lập trong buồng mẫu, quá trình cộ đọng và bay hơi là cân bằng. Khối lượng phân tử bay hơi bằng với khối lượng phân tử cô đọng. Tại mức áp suất cao hơn, tốc độ cô đọng lớn hơn tốc độ thăng hoa – tinh thể nước đóng băng sẽ hình thành trên bề mặt mẫu. Tình huống này phải được loại bỏ trong mọi tình huống. Một đĩa lạnh (có nhiệt độ lạnh hơn nhiệt độ mẫu) ở phía trên mẫu sẽ làm giảm áp suất cục bộ và vận hành như là một bẫy lạnh. Phân tử nước từ mẫu sẽ hướng về bề mặt lạnh hơn. Tại mức áp suất thấp hơn áp suất bão hòa thì phân tử thăng hoa nhiều hơn phân tử cô đọng và quá trình ăn mòn kết đông sẽ diễn ra.

 

Thực hiện quá trình ăn mòn kết đông cho đến khi mẫu hoàn toàn không còn nước đóng băng, được gọi là sấy khô kết đông (freeze drying). Quá trình này chỉ thực hiện được với mẫu nhỏ trong một khoảng thời gian phù hợp. Quá trình nâng mức nhiệt độ từ -120 oC lên -60 oC trải quá một vài bước, trong đó mức nhiệt độ của mỗi bước được duy trì trong một khoảng thời gian nhất định. Quá trình này có thể kéo dài vài ngày.

 

Hình 4: Áp sất bay hơi bão hòa (Umrath 1982)

 

Tại mức nhiệt độ mẫu ở -120oC, tốc độ ăn mòn rất thấp, thời gian ăn mòn kéo dài đến mức không hiện thực. Nếu mức áp suất của buồng chân không cố định thì có thể tăng tốc độ ăn mòn bằng cách nâng cao nhiệt độ mẫu. Thận trọng với mức nhiệt độ cao hơn -90oC đối với mẫu sinh học. Tốc độ ăn mòn sẽ tăng đáng kể. Thêm vào đó, nước đóng băng có sáu cạnh sẽ được hình thành từ nước đóng băng liên kết, gây ra thành phần lạ từ quá trình khử nước.

 

Tốc độ thăng hóa lý thuyết của nước tinh khiết bị suy giảm bởi các yếu tố sau:

 

  • Nước bên trong mẫu thăng hoa chậm hơn trên bề mặt
  • Dung môi muối và đại phân tử làm suy giảm tốc độ thăng hoa
  • Nước liên kết được coi là thành phần của mẫu sinh học có tốc độ thăng hoa thấp hơn

 

 

Tách mẫu kết đông tạo hình ảnh hiển vi

 

Kỹ thuật tách mẫu kết đông và ăn mòn kết đông đòi hỏi mẫu phải được phủ màng cực mỏng với vật liệu kim loại nặng và cacbon trong điều kiện chân không.

 

Mẫu tách kết đông được phủ màng theo góc với kim loại, sau đó là với màng cacbon (Leica EM ACE600 phiên bản tách mẫu kết đông hoặc Leica EM ACE 900 với Leica EM VCT500) để tạo ra bản sao chụp ảnh trên kính hiển vi truyền qua (TEM) hoặc mặt cắt cho quan sát trên kính hiển vi điện tử quét (SEM).

 

Vói cả hai phương pháp, bề mặt được tách đều được phủ màng sau khi đã được ăn mòn. Đầu tiên một lớp màng kinh loại (2nm đến 7nm) được phủ dưới góc 90o để ổn định màng kim loại cực mỏng. Tại đây, quá trình ăn mòn sẽ kết thúc. Để có thể quan sát được cấu trúc cực nhỏ thì lớp kim loại nặng được phủ ở góc rất thấp (2 đến 8o) và mẫu được quay tròn trong quá trình phủ màng. Kỹ thuật này sẽ nâng thêm độ tương phản cho các cấu trúc nhỏ. Kỹ thuật này được gọi là hiệu ứng màng chắn góc thấp.

 

Bốc bay điện tử được sử dụng cho các lớp màng kim loại nặng. Đây là kỹ thuật phủ màng cho độ mịn cao và lắng đọng định hướng. Lớp màng hỗ trợ bằng cacbon có chức năng ổn định cấu trúc không được phủ kim loại. Những cấu trúc này sẽ thay đổi đường viền trên quá trình nhiệt độ tăng lên, mẫu sẽ không dẫn điện hoàn toàn và một bản sao sẽ không được kết bám.

 

Hiệu ứng màng chắn một phương

 Hình 5: Ảnh trái: Chụp bằng hiển vi Cryo-SEM, tín hiệu BSE. Ảnh phải: Bản sao, ảnh TEM

 

Ứng dụng:

Hình 6: Kết đông áp suất cao, Leica EM VCT100 chuyển mẫu tới Leica EM BAF060 để ăn mòn kết đông và phủ màng nhiệt độ thấp sử dụng súng điện tử và giá mẫu xoay tròn. Leica EM VCT100 chuyển mẫu đến cryo-SEM. Deo formula trên nền dầu/nước, khoảng 3 phút -100oC (thăng hoa) cho thấy lớp lipid.

 

 

   

 

Hình 7: Kết đông áp suất cao, Leica EM VCT100 chuyển mẫu đến Leica EM BAF060 để tách và ăn mòn kết đông, phủ màng nhiệt độ thấp. EM VCT100 chuyển mẫu đến cryo-SEM. Tảo cát lông chim từ hỗn hợp nuôi cấy của đơn bào Euplote.

Hình 8: Kết đông áp suất cao, tách, ăn mòn kết đông và phủ mẫu nhiệt độ thấp với Leica EM BAF060/Leica EM VCT100 chuyển mẫu đến cryo-SEM. Nhũ tương dầu/nước thể hiện kết cấu lá mỏng giống củ hành tạo nên các cấu trúc giọt nước.

 

   
Hình 9: Ảnh TEM bản sao tế bào men bia. Kết đông áp suất cao và tách mẫu kết đông bằng Leica EM BAF060. Hình 10: Nấm mốc trên lá lúa mạch. Mẫu được gắn lên bệ mẫu của Leica EM BAF060 và được đông kết bằng bàn mẫu lạnh sử dụng nitơ lỏng. Leica EM BAF060 sấy khô kết đông một phần (sấy khô kết đông tại mức nhiệt độ mẫu cao hơn). Phủ màng vônfram. Leica EM VCT100 chuyển mẫu tới Croy-FESEM 5kV.

 

Giới thiệu thiết bị chuẩn bị mẫu hiển vi Leica

 

Tin liên quan