Hiển vi điện tử truyền qua nhiệt độ thấp
Một phương pháp được sử dụng để xử lý cả hai vấn đề sấy khô mẫu trong quá trình chuẩn bị mẫu lẫn bay hơi nước trong cột súng là cho mẫu vào một giá giữ mẫu đặc biệt được làm lạnh đến -190oC hoặc thấp hơn, trong trạng thái đóng băng (kết đông) với tốc độ thăng hoa tối thiểu. Kỹ thuật này, được biết biết đến như là kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua nhiệt độ thấp (cryo-TEM), cryo-TEM là phương tiện không thể thiếu trong công tác nghiên cứu cấu trúc sinh vật trong những thập kỷ vừa qua.
Đối với những mẫu có độ mỏng vừa đủ như phức hợp đại phân tử cô lập, vi rút, tế bào vi sai thì quá trình chuẩn bị mẫu chỉ còn một bước: cố định vật lý bằng kỹ thuật kết đông nhúng chìm. Bài viết này mô tả những nội dung căn bản của kỹ thuật chuẩn bị mẫu này.
Kết đông nhúng chìm
Hình 1: Chuẩn bị lưới giữ mẫu
Một trong những điều kiện tiên quyết để có thể quan sát được mẫu đúc trong nước đóng băng là bắt được các phân tử nước tại chỗ trong một khoảng thời gian rất ngắn để không cho quá trình hình thành tinh thể đá xảy ra, lý tưởng nhất là trạng thái nước đóng băng vô định hình (vitrified). Trong trường hợp với kỹ thuật kết đông nhúng chìm, kết quả lý trưởng chỉ đạt được khi hỗn hợp làm lạnh với độ dẫn nhiệt cao được sử dụng và chỉ khi mẫu được nhúng chìm nhanh để đảm bảo quá trình kết đông diễn ra nhanh chóng. Hỗn hợp làm lạnh phù hợp bao gồm ethan, propan hóa lỏng hoặc kết hợp cả hai loại hóa chất này [xem tài liệu tham khảo [1] được thao tác ngay trên nhiệt độ nóng chảy (-183oC và -188oC đối với hợp chất tinh khiết). Hơn nữa khoảng cách của bất kỳ điểm nào trên mẫu tới bề mặt tiếp xúc với hỗn hợp làm lành phải ngắn, chẳng hạn như mẫu phải rất mỏng.
Bộ phận mang mẫu trong kính hiển vi điện tử truyền qua nhiệt độ thấp (cryo-TEM) phải hỗ trợ hiệu quả cho mẫu vật. Bộ phận mang mẫu phải dẫn điện tốt để không gây ra hiện tượng tích điện và các vấn đề về độ trôi dịch. Tất cả những yêu cầu này được thỏa mãn ở mức nào đó bằng lưới giữ mẫu TEM tiêu chuẩn có màng cac-bon khoét lỗ. Xử lý trước lưới mang mẫu bằng quáy trình làm sạch plasma hay phóng điện hoặc phủ màng protein ma trận có thể cần thiết để đảm bảo độ phân bố dung dịch nước được đồng đều.
Trong kỹ thuật kết đông nhúng chìm, lưới giữ mẫu được thao tác bằng kẹp cố định trên hệ thiết bị giống như máy xén giấy (Hình 1), một lượng nhỏ mẫu (3 ~ 5µl) trong dung dịch nước được nhỏ lên, sau đó phần lớn dung dịch được thấm nước bằng giấy lọc để làm giảm độ dày của lớp dư cặn. Bước làm này là cần thiết cho quá trình nước đóng băng vô định hình (xem bên trên) và cũng giúp đạt được độ mỏng đủ để cho chùm tia điện tử xuyên qua, đối với hầu hết các loại mẫu thì không cần thêm bất kỳ thao tác chuẩn bị nào nữa. Độ dày chính xác phụ thuộc vào từng loại mẫu và loại kính hiển vi, thông thường thì lớp nước đóng băng phải mỏng nhất có thể, nhưng không được dày hơn 500nm. Phạm vi độ dày này cũng đảm bảo kết quả kết đông đáng tin cậy bằng kỹ thuật mô tả ở trên.
Ngay sau khi thấm nước, mẫu phải được nhúng nhanh vào hợp chất làm lạnh. Sau khi được đông kết, mẫu được ngâm vào LN2 để lưu trữ trước khi quan sát bằng hiển vi điện tử truyền qua.
Thách thức
Hình 2: Máy kết đông nhúng chìm tự động Leica EM GP
Yếu tố cốt lõi để tạo ra trạng thái nước đóng băng là phải làm lạnh nhanh hiệu quả nhưng phải duy trì được nước đóng băng ở trạng thái vô định hình: ý sau yêu cầu mẫu phải luôn được giữa ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tái kết tinh. Kết quả này có thể thực hiện bằng cách cho lưới giữ mẫu trong khí môi trường LN2 hoặc N2 lạnh và cần chú ý làm lạnh trước cất cả các dụng cụ thao tác mẫu.
Một yếu tố quan trọng khác đó là nhiễm bẩn đối với mẫu kết đông bởi độ ẩm lắng đọng trên bề mặt, tạo ra những tinh thể đá cỡ nano. Khi mẫu được chụp ảnh trong môi trường kết đông (đối ngược với các phương pháp như thay thế kết đông [freeze substitution] hoặc cắt lát nhiệt độ thấp Tokuyasu có tinh thể bề mặt được loại bỏ) thì các đối tượng nhiễm bẩn được phân biệt bằng các chi tiết có độ tương phản cao trên ảnh TEM, tình huống này cần phải tránh không gặp phải. Thách thức này có thể vượt qua bằng một số lưu ý, giảm độ ẩm khí quyển xung quanh và thời gian mẫu tiếp xúc với môi trường này: thông thường, phòng thí nghiệm được hút ẩm là cần thiết, mẫu phải được giữ trong LN2, hơi thở lên mẫu cùng cần tránh, di chuyển mẫu cần thực hiện nhanh trong môi trường N2 lỏng và khô ngay phía trên pha lỏng, sử dụng các dụng cụ thao tác được vệ sinh sạch, kính hiển vi phải có độ chân không sạch tại khu vực vật kính bằng cách sử dụng thiết bị chống nhiễm bẩn.
Thậm chí khi mẫu được kết đông hoàn hảo thì vẫn không đạt được kết quả khả qua nếu mẫu không được thao tác phù hợp trước khi kết đông. Một vấn đề tiềm ẩn nữa đó là nhiệt độ mẫu trong một thiết bị không được kiểm soát như Hình 1: định vị vị trí không xác định phía trên bồn LN2, mẫu tiếp xúc với nhiệt độ phòng hoặc khí lạnh, gây ra trạng thái các chi tiết không được thể hiện rõ nét.
Trên cùng một thiết bị, cho dù có làm việc trong phòng có độ ẩm thấp như khuyến cáo ở trên, thì những thách thức kỹ thuật vẫn phát sinh từ quá trình bay hơi của dung môi; xem tài liệu tham khảo [2], nước bay hơi tại tốc độ 50 nm/giây từ một lớp màng mỏng tại nhiệt độ phòng và độ ẩm 30%. Quá trình này sẽ loại bỏ dung môi và làm giàu chất muối trong khi các chất hòa tan khác cũng tác động lớn đến kết quả đạt được với mẫu vật chứa nước.
Cho dù với loại thiết bị cơ bản như Hình 1 thì cũng có thể thu được kết quả khả quan bởi những kỹ thuật viên có nhiều kinh nghiệm, cho dù vậy vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề. Với những thách thức kỹ thuật trên, các phòng thí nghiệm phải tự thiết kế các thiết bị chuyên dụng có buồng chứa mẫu môi trường và cơ cấu thấm nước tự động cho riêng mình. Những thiết bị thương mại hóa bởi các nhà sản xuất khác nhau sẽ tiếp bước theo sau (xem chi tiết tại tài liệu tham khảo [3]), trong đó bao gồm cả máy kết đông nhúng chìm Leica EM GP của Leica Microsystems, thiết bị này được phát triển với sự hợp tác cùng Phòng thí nghiệm hiển vi điện tử IMP/IMBA, Vienna (Hình 2).
Tài liệu tham chiếu:
- Tivol WF, Briegel A, and Jensen GJ: An improved cryogen for plunge freezing. Microsc. Microanal. 14: 375–79 (2008).
- Frederik PM, and Hubert DHW: Cryoelectron microscopy of liposomes. Methods Enzymol. 391: 431–48 (2005).
- Dobro MJ, Melanson L, Jensen GJ, and McDowall AW: Plunge freezing for electron cryomicroscopy in: Methods in enzymology 481: 63–82 (2010).
