Kính hiển vi (microscope) là thiết bị để quan sát các vật thể có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được. Khoa học nhằm khám phá và kiểm tra những vật thể nhỏ nhờ một thiết bị như vậy được gọi là khoa học hiển vi (microscopy). Hình ảnh hiển vi của vật thể được phóng đại thông qua một hoặc nhiều thấu kính, hình ảnh này nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của thấu kính (hoặc các thấu kính). Khả năng quan sát của kính hiển vi được quyết định bởi độ phân giải.
Năm 1590, hai cha con thợ làm kính mắt người Hà Lan: Hans Janssen và Zaccharias Janssen đã phát minh ra kính hiển vi đầu tiên. Sau đó, Anton van Leeuwenhoek (1623 - 1732), Hà Lan, là người đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi để quan sát tế bào hồng cầu, nấm, vi khuẩn, tinh trùng và các vi sinh vật trong nước... Từ đó, rất nhiều khám phá và công trình nghiên cứu được công bố, Anton van Leeuwenhoek được coi là “Cha đẻ của khoa học hiển vi – Father of Microscopy) cho dù ông chưa từng được học qua trường lớp nào. Robert Hook (1635 – 1703) đã sử dụng nguồn sáng để quan sát thế giới vi sinh vật bằng kính hiển vi, ông cũng chính là người đầu tiên quan sát được cấu trúc tế bào. Cuốn sách “Hình ảnh hiển vi” được xuất bản năm 1665 đã mô tả rất nhiều đối tượng mà mắt thường không nhìn thấy được. Ông cũng được tôn vinh là “Cha đẻ của khoa học hiển vi người Anh”.
Trong những thập kỷ gần đây, nhờ sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, các thế hệ kính hiển vi hiện đại liên tục được giới thiệu và tung ra thị trường với nhiều tính năng ưu việt. Do vậy, rất khó để phân ra chính xác thành từng loại kính hiển vi. Tuy nhiên, một số nhóm kính hiển vi có thể được tóm lược như sau: kính hiển vi quang học (kính hiển vi ánh sáng truyền qua, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi phản pha, kính hiển vi soi ngược, kính hiển vi phân cực, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi đồng tụ,…), kính hiển vi điện tử (kính hiển vi điện tử truyền qua - TEM, kính hiển vi điện tử quét - SEM,…), kính hiển vi quét đầu dò (kính hiển vi lực nguyên tử - AFM, kính hiển vi quét chui hầm - STM, kính hiển vi quang học quét trường gần – SNOM,…)
Bài này chỉ tập trung giới thiệu một số loại kính hiển vi quang học được sử dụng phổ biến tại các phòng xét nghiệm vi sinh ở Việt Nam.
Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (transmitted light microscope) là loại kính hiển quang học được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, thường sử dụng một nguồn ánh sáng trắng rọi qua mẫu đặt trên một lam kính để quan sát hình dạng và vi cấu trúc của mẫu. Ảnh của mẫu là hình ảnh hai chiều.
Kính hiển vi soi nổi (stereoscopic microscope) là loại kính hiển vi quang học được thiết kế để quan sát hình ảnh bề mặt của mẫu vật thể ở độ phóng đại thấp. Loại kính này thường sử dụng chùm ánh sáng trắng chiếu tới bề mặt của vật thể, hình ảnh tạo ra bởi ánh sáng phản xạ thông qua hai trục quang học riêng biệt với hai vật kính (hoặc một vật kính phẳng), hệ thống kính phóng và đến thị kính,. Ảnh của mẫu vật thường là hình ảnh 3 chiều.
Kính hiển vi phân cực (polarizing microscope) là loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng phân cực để quan sát, nghiên cứu định tính và định lượng những mẫu có đặc tính lưỡng chiết (có hai chỉ số khúc xạ). Kính hiển vi phân cực có khả năng cung cấp những thông tin về màu hấp thụ và đường biên quang học giữa các chất liệu khác nhau (có chỉ só khúc xạ khác nhau) trong cùng một mẫu. Hình ảnh hiển vi phân cực có độ tương phản cao.
Kính hiển vi quang học có hai nicon phân cực ánh sáng, đặt thẳng góc nhau: nicon phân cực đặt dưới mâm kính, nicon phân tích đặt giữa vật kính và thị kính. Mẫu đá hoặc khoáng vật mài mỏng tới bề dày 0,03 mm, được gắn bằng nhựa Canađa vào tấm thuỷ tinh và đặt trên mâm kính. KHVPC cho phép xác định các hằng số quang học của khoáng vật (chiết suất, lưỡng chiết suất, góc quang học, màu tự nhiên, màu đa sắc của khoáng vật kim loại) và nhờ đó có thể xác định chính xác tên khoáng vật.
Kính hiển vi huỳnh quang (flourescence microscope) là loại kính hiển vi quang học sử dụng một nguồn ánh sáng kích thích để nghiên cứu, quan sát các thuộc tính của mẫu sinh học sau khi mẫu này nhuộm với chất phát huỳnh quang (hoặc mẫu tự phát huỳnh quang). Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang cũng cho phép quan sát những thuộc tính sinh hóa và sinh lý học của các tế bào sống. Phụ thuộc vào mục đích và đối tượng cần quan sát mà mẫu có thể nhuộm với những chất phát huỳnh quang khác nhau sử dụng ánh sáng có bước sóng kích thích khác nhau.
Gồm các bộ phận chủ yếu sau:
- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen).
- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng (nếu có)
- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)
- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)
- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát
- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x.
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)
- Ống nối với camera (nếu có).
Hình 1. Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (Leica DM3000 LED)
Gồm các bộ phận chủ yếu sau :
- Nguồn sáng phản xạ (và truyền qua)
- Bệ kính giữ thăng bằng có giá đặt mẫu
- Lăng kính
- Ống quan sát
- Vật kính : thường bao gồm hai vật kính hoặc vật kính phẳng cố định, cho phép quan sát mẫu vật ở các góc độ khác nhau. Độ phóng đại điển hình của vật kính : 1x ; 1,5x ; 2x.
- Núm chỉnh độ phóng đại
- Núm chỉnh độ hội tụ
- Thị kính : là một ống hình trụ mang thấu kính. Độ phóng đại điển hình của thị kính : 10x, 15x, 20x và 30x
- Ống nối camera (nếu có)
Hình 2. Cấu tạo của kính hiển vi soi nổi (Leica EZ4)
Gồm các bộ phận chủ yếu sau :
- Nguồn sáng (sợi đốt, halogen…)
- Tụ quang
- Bộ phân cực ánh sáng (thường được lắp cố định phía dưới tụ quang)
- Giá đỡ mẫu có khả năng xoay vòng
- Mâm vật kính
- Bộ phân tích (có khả năng xoay vòng với góc đọc nhỏ)
- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình khác nhau như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x.
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô, chỉnh tinh)
- Bệ đỡ kính
- Ống nối với camera (nếu có)
Hình 3. Kính hiển vi phân cực (Leica DM4 M & DM6 M)
Gồm các bộ phận chủ yếu sau :
- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen)
- Nguồn sáng kích thích huỳnh quang (đèn hơi thủy ngân, đèn hồ quang xenon…)
- Tụ quang để hội tụ chùm sáng
- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng
- Gương lưỡng hướng sắc (hoặc bộ phân chia chùm tia lưỡng sắc)
- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)
- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)
- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát.
- Vật kính : là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính : là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)
- Ống nối với camera
Hình 4. Kính hiển vi huỳnh quang (Leica DM6 FS)
Hình 5. Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi ánh sáng truyền qua
Ánh sáng khả kiến từ nguồn được tập trung lại khi đi qua tụ quang để truyền qua mẫu đặt trên lam kính. Sau đó, ảnh của mẫu được tạo thành và phóng đại lần thứ nhất nhờ một thấu kính có tiêu cự ngắn (vài mm) gọi là vật kính. Hình ảnh này có thể tiếp tục được phóng đại lên nhiều lần nhờ thấu kính phóng. Hình ảnh phóng đại cuối cùng của mẫu là ảnh thật, quan sát được nhờ thị kính (có tiêu cực dài hơn rất nhiều so với tiêu cự của vật kính) hoặc được ghi lại nhờ CCD camera. Độ phân giải của ảnh hiển vi quang học bị hạn chế bởi nhiễu xạ. Theo công thức của Abbe – Rayleigh, khoảng cách nhỏ nhất dmin giữa hai điểm có khả năng phân biệt được tính theo công thức:
dmin = 1,22l/2NA
trong đó l là bước sóng ánh sáng, NA = n x sinα được gọi là khẩu độ số của vật kính, n là chiết suất của môi trường mẫu quan sát, α là bán góc mở cực đại của vật kính khi quan sát mẫu.
Hình 6. Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi soi nổi
Kính hiển vi soi nổi được thiết kế để quan sát mẫu vật thể ở độ phóng đại thấp. Ảnh hiển vi soi nổi thường được tạo thành nhờ ánh sáng phản xạ trên bề mặt mẫu sau khi được chiếu sáng hơn là ánh sáng truyền qua. Ánh sáng phản xạ đi qua hai vật kính hoặc một vật kính phẳng theo hai trục quang học song song tạo nên hình ảnh ba chiều nhờ khả năng quan sát mẫu từ các góc độ khác nhau (γ). Nhờ sử dụng các kính viễn vọng kiểu Galilê đặt trên một trống xoay (hoặc hệ thống các thấu kính có khả năng phóng to hoặc thu nhỏ) nên có khả năng thay đổi được độ phóng đại của ảnh theo ý muốn.
Hình 7. Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi phân cực
Không giống như các loại kính hiển vi quang học khác, kính hiển vi phân cực được thiết kế để quan sát mẫu khi sử dụng ánh sáng phân cực và đặc tính quang học không đẳng hướng của mẫu. Loại mẫu này có những liên kết nội phân tử phân cực tương tác với ánh sáng phân cực theo một hướng nhất định dẫn đến sự trễ pha. Quá trình này được kiểm soát nhờ sự biến đổi biên độ giao thoa tại mặt phẳng tạo ảnh ban đầu. Để quan sát các mẫu lưỡng chiết (có hai chỉ số khúc xạ khác nhau), kính hiển vi phải được trang bị hai bộ phân cực, một bộ đặt trên đường đi của chùm ánh sáng tới trước mẫu, bộ phân tích (bộ phân cực thứ hai) được đặt ở trục quang học giữa vật kính, sau khẩu độ và các ống quan sát hoặc camera. Độ tương phản của ảnh tạo ra nhờ tương tác giữa ánh sáng phân cực phẳng với mẫu lưỡng chiết để tạo ra hai thành phần sóng riêng biệt (tia bình thường và bất bình thường) phân cực trong các mặt phẳng vuông góc thay đổi lẫn nhau. Tốc độ của các thành phần này khác nhau và thay đổi hướng truyền khi đi qua mẫu. Sau khi đi qua mẫu, các thành phần ánh sáng truyền lệch pha nhau nhưng tái kết hợp lại sau quá trình giao thoa khi đi qua bộ phân tích.
Hình 8. Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang hoạt động dựa trên nguyên lý sử dụng ánh sáng có bước sóng ngắn, năng lượng cao để kích thích các điện tử nội tại trong phân tử của mẫu nhảy lên quỹ đạo cao hơn (có mức năng lượng cao hơn). Khi các điện tử này quay trở lại quỹ đạo cũ (có mức năng lượng ban đầu khi chưa bị kích thích) chúng phát ra một ánh sáng có bước sóng dài hơn, năng lượng thấp hơn (thường nằm trong phổ ánh ánh sáng nhìn thấy) để tạo ra hình ảnh huỳnh quang. Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn xenon hoặc thủy ngân để tạo ra ánh sáng tia cực tím, qua bộ lọc để dẫn vào kính và đi đến gương lưỡng hướng sắc - loại gương có khả năng phản xạ dải bước bước sóng nhất định và cho phép một dải bước sóng khác đi qua. Gương này phản xạ ánh sáng tia cực tím lên mẫu để kích thích huỳnh quang nội tại trong các phân tử của mẫu. Vật kính sẽ thu lại những ánh sáng có bước sóng huỳnh quang được tạo ra đi đến gương lưỡng hướng sắc và thông qua một bộ lọc (để loại bỏ những ánh sáng không có bước sóng huỳnh quang) dẫn đến thị kính để tạo ảnh huỳnh quang.
- Người sử dụng kính hiển vi phải được đào tạo cơ bản về kiến thức liên quan.
- Người sử dụng kính lần đầu phải có sự hướng dẫn của người có kinh nghiệm.
- Đọc kỹ hướng dẫn của từng loại kính trước khi thao tác.
(1). Bật công tắc khối nguồn
(2). Nhấn công tắc khởi động trên kính
(3). Đưa bộ lọc sáng vào trục quang học (nếu có)
(4). Chỉnh tâm hai thị kính vào trục quang học
(5). Tăng tụ quang (nếu có) đến vị trí cao nhất (sử dụng núm hội tụ tụ quang)
(6). Lựa chọn vật kính 10x đưa vào trục quang học
(7). Mở hoàn toàn màn chắn sáng và khẩu độ
(8). Đưa mẫu và dịch chuyển giá đỡ mẫu đến vị trí phù hợp để quan sát
(9). Điều chỉnh độ hội tụ
(10). Điều chỉnh diop và thị kính phù hợp với mắt
(11). Điều chỉnh độ hội tụ và chuẩn tâm tụ quang
(12). Lựa chọn vật kính có độ phóng đại mong muốn (lưu ý: khi thay đổi vật kính, có thể không quan sát được hình ảnh của mẫu, do đó phải điều chỉnh độ hội tu và khoảng cách giữa vật kính và mẫu).
(13). Khi chụp ảnh hoặc quan sát mẫu bằng camera, phải mở chốt ngăn trục quang học (chốt này thường ở ngay dưới ống nối camera)
(14). Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết thúc
(1). Bật công tắc nguồn.
(2). Điều chỉnh cường độ sáng thích hợp (nếu có)
(3). Điều chỉnh hai núm hội tụ một cách nhẹ nhàng để đạt được khoảng cách làm việc tốt nhất từ mẫu đến vật kính. (Chú ý: luôn phải điều chỉnh cả hai núm hội tụ ở hai bên thân kính, tránh để kính rơi tự do)
(4). Điều chỉnh khoảng cách giữa hai thị kính để phù hợp với mắt người quan sát.
(5). Điều chỉnh điốp để phù hợp với mắt.
(6). Điều chỉnh độ hội tụ và khoảng cách làm việc.
(7). Thay đổi độ phóng đại, nếu muốn.
(8). Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết thúc
(1). Bật công tắc nguồn.
(2). Điều chỉnh thị kính để phù hợp với mắt quan sát
(3). Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học để quan sát bằng hai thị kính
(4). Đưa vật kính 10x vào trục quang học. Chỉnh thẳng chùm sáng
(5). Chỉnh tâm tụ quang
(6). Đưa mẫu lên giá và chỉnh tâm giá giữ mẫu
(7). Chỉnh tâm vật kính
(8). Điều chỉnh độ mở thích hợp của màng chắn khẩu độ và màng chắn trường
(9). Điều chỉnh độ hội tụ
(10). Chọn vật kính phù hợp và sử dụng một giọt dầu nhúng vật kính khi quan sát
(11). Điều chỉnh và lựa chọn chế độ quan sát thích hợp
(12). Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học để ghi nhận hình ảnh bằng camera
(13). Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết thúc
(1). Bật công tắc nguồn
(2). Bật công tắc khởi động kính và điều chỉnh độ sáng thích hợp
(3). Đưa các bộ lọc ánh sáng vào trục quang học (ví dụ: đưa các bộ lọc ND8, ND32 và NCB11 đến chế độ IN ở kính Eclipse 90i, Nikon).
(4). Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học để quan sát bằng hai thị kính.
(5). Nâng tụ quang lên vị trí cao nhất (ví dụ: sử dụng núm chỉnh hội tụ tụ quang ở kính Eclipse 90i, Nikon).
(6). Chọn vật kính 10x vào trục quang học
(7). Mở hoàn toàn màng chắn trường và màng chắn khẩu độ
(8). Đưa mẫu lên giá và dịch chuyển giá mẫu (lên, xuống hoặc/và theo chiều ngang, dọc) đến trường quan sát
(9). Chỉnh hội tụ mẫu.
(10). Chỉnh điốp và khoảng cách giữa các thị kính để phù hợp với mắt quan sát
(11). Chỉnh núm hội tụ tụ quang và chỉnh tâm tụ quang bằng các vít (cố định mâm tụ quang xoay).
(12). Chọn vật kính thích hợp để quan sát mẫu
(13). Hạ thấp tụ quang đến vị trí thấp nhất
(14). Tắt nguồn sáng truyền qua (diascopic)
(15). Đưa bộ lọc ánh sáng kích thích vào trục quang học
(16). Mở hoàn toàn màng chắn khẩu độ cho ánh sáng kích thích huỳnh quang
(17). Kiểm tra cửa trập cho ánh sáng kích thích huỳnh quang đã đóng và mở nguồn sánh kích thích huỳnh quang.
(18). Mở cửa trập của ánh sáng kích thích huỳnh quang và chỉnh tâm đèn.
(19). Đưa vật kính 10x vào trục quang học
(20). Đưa mẫu vào giá đỡ và và dịch chuyển giá mẫu (lên, xuống hoặc/và theo chiều ngang, dọc) đến trường quan sát
(21). Chỉnh hội tụ
(22). Chỉnh tâm màng chắn trường
(23). Chọn vật kính thích hợp để quan sát mẫu
(24). Để ghi lại hình ảnh hiển vi bằng camera, ta thực hiện các bước sau:
+ Chỉnh kính để quan sát hình ảnh rõ ràng trước
+ Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học sang chế độ hiển thị trên camera
+ Điều chỉnh đầu camera đến đúng vị trí để đạt được hình ảnh rõ nét nhất trên màn hình.
+ Thiết lập các chế độ cài đặt của camera
+ Lựa chọn chế độ camera phù hợp cho đối tượng quan sát
+ Chỉnh chuẩn camera và hình ảnh
+ Chụp và lưu lại hình ảnh.
(25). Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết thúc
- Đặt kính ở nơi khô thoáng, không bị nấm mốc.
- Giữ các vật kính và thị kính trong hộp để nơi khô thoáng cùng với chất hút ẩm (túi silicagel, nếu có).
- Tắt nguồn điện và đợi cho nguồn sáng (bóng đèn) nguội hẳn rồi mới che đậy thiết bị.
- Khi không sử dụng kính, phải che phủ cẩn thận để tránh bụi.
- Kính hiển vi phải được hiệu chuẩn và bảo dưỡng định kỳ hệ quang học trong kính theo hướng dẫn của nhà sản xuất (thường từ 3 – 6 tháng/lần). Giữ liên lạc thường xuyên với đại diện của hãng kính hiển vi hoặc đại lý phân phối tại Việt Nam.
- Phải có người phụ trách kỹ thuật và trang thiết bị: hiểu rõ về nguyên lý cũng như cách sử dụng kính hiển vi, chịu trách nhiệm về tình trạng của kính.
- Có sổ theo dõi sử dụng kính hiển vi: ghi ngày, giờ sử dụng; mẫu quan sát; người sử dụng; tình trạng của kính trước và sau khi sử dụng.
- Khi kính hiển vi có sự cố phải thông báo ngay với cấp trên và liên hệ sửa chữa, bảo dưỡng với kỹ sư đại diện ở Việt Nam của hãng sản xuất kính.
- Khi kính hiển vi bị hỏng không thể khắc phục, phải báo với bộ phận có thẩm quyền để thanh lý thiết bị theo quy định, không tự ý thanh lý thiết bị.
- Kiểm tra sổ theo dõi sử dụng kính để biết tình trạng của kính.
- Kiểm tra nguồn điện, nguồn sáng cho kính.
- Lau chùi bụi của kính hàng ngày bằng khăn lau sạch
- Không được làm xước, làm bẩn thấu kính, bộ lọc. Nếu thấu kính hay bộ lọc bị bẩn phải lau chùi bằng giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen hoặc cồn.
- Không để đèn phát sáng bị bẩn.
- Không chạm tay vào nguồn sáng, dễ bị bỏng.
- Nguồn sáng tia cực tím của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến sức khỏe.
- Sử dụng dầu nhúng khi quan sát với vật kính có độ phóng đại lớn (tùy theo từng loại kính và mẫu quan sát)
- Khi kết thúc quá trình quan sát mẫu, phải tắt nguồn điện và che phủ kính cẩn thận.
- Ghi vào sổ theo dõi sử dụng kính.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 - Instruction of microscope - eclipse 90i, Nikon
2- http://www.microscopyu.com
3 - http://www.olympusmicro.com
4 - http://www.leica-microsystems.com
5 - Julian P. Heath. Dictionary of Microscopy. Wiley, 2005
