Nước là thành phần quan trọng của tế bào, do đó việc giữ nguyên được siêu cấu trúc tế bào là điều rất quan trọng. Cho tới nay thì chỉ có một cách duy nhất để cố định các phần tử tế bào mà không làm thay đổi cấu trúc là cố định nhiệt độ thấp (cryo-fixation). Có hai phương pháp phổ thông thường được sử dụng là: đông kết nhúng chìm (plunge freezing) và đông kết áp suất cao (high pressure freezing).
Cố định nhiệt độ thấp có hai lợi ích rõ ràng so với cố định hóa chất. Đó là kết quả đạt được chỉ trong vài mili giây và nó còn đảm bảo quá trình cố định đồng thời các thành phần đại phân tử. Nhiều hệ protein rất dễ rụng khi có bất kỳ thay đổi nhỏ nhất nào về nhiệt độ và độ thẩm thấu, những tác động không mong muốn này sẽ được tối thiểu nhờ kỹ thuật cố định nhiệt độ thấp. Kỹ thuật này cho phép nghiên cứu các mẫu sinh học với khả năng duy trì siêu cấu trúc, ngoài ra còn hỗ trợ công tác nghiên cứu các quá trình vận hành động.
Hiện nay, chỉ có một phương pháp duy nhất để cố định mẫu có độ dày lớn (đến 200µm) là kết đông áp suất cao (HPF).
Mouse embryonic fibroblast grown on sapphire disc (courtesy of Verkade P, University of Bristol, UK).
Cố định nhiệt độ thấp thành công là quá trình chuyển đổi nước từ dạng chất lỏng sang trạng thái vô định hình mà không tác động đến hạt nhận của tinh thể nước đóng băng. Hạt nhân của tinh thể nước đóng băng phụ thuộc và áp suất và nhiệt độ (xem biểu đồ mô tả ở phía dưới). Quá trình thủy tinh thể hóa phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh trong quá trình kết đông là một quá trình phụ thuộc vào thời gian. Tốc độ làm lạnh phụ thuộc vào các đặc tính nhiệt của nước, độ dày mẫu và độ tản nhiệt trên bề mặt mẫu.
Phát kiến đông kết mẫu sinh học dưới điều kiện áp suất được giới thiệu lần đầu bởi Moor và Riehle (1986). Thiết bị kết đông áp suất cao (HPF) được thương mại hóa từ năm 1985. Tất cả các máy HPF hiện nay mặc dù có thiết kế khác nhau nhưng vẫn có chung nguyên lý hoạt động là đồng thời làm lạnh và tạo áp thời trong khoảng thời gian cực ngắn 20 mili giây.
Biểu đồ trên (Kanno et al. 1975) cho thấy trạng thái nước phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất. Tại áp suất 2045 bar, điểm nóng chảy của nước xuống tới 251K và nhiệt độ cho hạt nhận đồng nhất giảm xuống đến 181K.
Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật đông kết áp suất cao được giới thiệu bởi Leunissen và Yi (J. Microsc. 235: 25-35 [2009]), một công nghệ mới đã được phát triển bởi Leica Microsystems.
Công nghệ này sử dụng xu hướng biến đổi của nước chứa bên trong hộp chứa mẫu gắn kín trên quá trình làm lạnh, bằng phương pháp này thực chất áp suất đã được tạo ra thay vì sử dụng một hệ thống thủy lực lắp ngoài. Lượng áp suất này là kết quả của quá trình kết tinh và hình thành đá đóng băng mật độ thấp bên trong hộp chứa mẫu gắn kín. Để đạt được áp (2010 bar) mà ở đó độ nóng chảy của đá thấp hơn 251K (Kano et al. 1975, Science 189: 880-881 [1975]) thì 60% nước bên trong hộp mẫu cần được chuyển đổi thành đá mật độ thấp.
Quá trình hình thành đá đóng băng mật độ thấp gây ra hiện tượng giãn nở thể tích tương quan với nước ở dạng lỏng. Mô phỏng số cho thấy quá trình kết đông dọc theo thành ống dẫn đến kết quả kết đông ở khu vực trung tâm của ống, tạo ra bề mặt đá đóng băng dạng cong rất cứng. Hiệu ứng này trở nên rõ ràng khi tốc độ nhúng chìm cao nhất. Vị trí tiếp xúc giữa vùng mật độ thấp và vùng kết đông tốt được xem là vị trí tốt nhất khi bề mặt nước đá đóng băng trở nên phẳng nhất. Kết quả này có thể đạt được bằng cách thay đổi các thông số làm kết đông ở những trường hợp khác nhau với máy kết đông áp suất cao Leica EM SPF. Trong quá trình dịch chuyển nhúng chìm, quá trình hình thành bề mặt đá đóng băng bên trong ống luôn ở phía trên bề mặt tác nhân làm lạnh. Khoảng cách của bề mặt đá đóng băng này phụ thuộc vào tốc độ nhúng chìm.
Ảnh 1: Ảnh tổng quan tế bào PtK2 trồng trên đĩa ngọc bích. Ô vuông xác định vị trí trên lưới đồng được định vị ngay phía trên tế bào để đánh dấu vị trí mẫu.
Ảnh 2: Hình ảnh huỳnh quang và DIC (tương phản giao thoa khác biệt). Khi tế bào quan tâm được định vị, hình ảnh DIC và huỳnh quang (internalized EGF-QD6555) được chụp. Ảnh chồng (ảnh bên phải) cho thấy vị trí của EGF-QD655 bao gồm các cấu trúc của tế bào. Vị trí đánh dấu bằng ô vuông là vị trí được quan tâm của tế bào.
Ảnh 3: Chấm lượng tử huỳnh quang bên trong tế bào. Các cấu trúc có các chấm lượng tử bên trong tế bào được quan sát trực tiếp, dựng phim chuỗi ảnh được chụp mỗi giây. Hình ảnh tĩnh được hiển thị trong 5 giây. Ảnh cuối là ảnh chụp cuối cùng trong chuỗi ảnh (do đó thời gian = 0 giây). Tại đây, bộ nạp mẫu nhanh được chuyển từ vị trí gá trên bệ mẫu vào máy kết đông áp suất cao, sau đó mẫu được kết đông.
Hình 4: Ảnh hiển vi điện tử mẫu tế bào (trái), phóng đại để quan sát thấy cấu trúc quan tâm (phải): Ảnh hiển vi điện tử tế bào được quan tâm (trái). Vị trí khoanh ô là cấu trúc quan tâm được phóng đại ở phía bên phải. Mũi tên chỉ chấm lượng tử được quan sát thấy bên trong cấu trúc. So sánh hình chữ C trong cấu trúc này với ảnh cuối ở Hình 3 thì cũng quan sát thấy hình chữ C. Lưu ý là ảnh hiển vi điện tử được cắt lát 70nm trong khi ảnh huỳnh quang được cắt lát khoảng 1µm. (Paul Verkade, University of Bristol, UK).
Courtesy of Verkade P, University of Bristol, UK.
Sản phẩm sử dụng cho ứng dụng này: Leica EM PACT2 with Leica EM RTS
Các lát cắt mỏng mẫu men bia được làm kết đông trong ống đồng hình chữ U trên thiết bị Leica HPM1000, chất kết dính tế bào được hòa với chất đệm MES/extran có độ pH 6.5 để nồng độ cuối cùng của MES là 50mM và của dexcan là 20%.
Mẫu được cắt lát siêu mỏng trong môi trường lạnh bằng thiết bị Leica EM UC7/EM FC7 với bộ phận thao tác tại nhiệt độ -140 °C và độ dày lát mỏng là 50nm. Các lát mỏng này được dính trên lưới đồng có chất tạo đông aga. Các lát mỏng được chụp bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 300kV và máy ảnh CCD 4K. Độ phóng đại là 23.000 lần, đặt cách tiêu điểm -6µm cho ảnh X quang và 8µm cho ảnh phóng chiếu hình, hiện tượng nhiễu xạ diễn ra trong chiều dài máy ảnh là 90mm. Hình A là ảnh trung bình của 10 lát cắt trung tâm được dựng lại bởi phần mềm IMOD từ một ảnh hiển vi.
Dr. Jonathan O’Driscoll, Dr. Daniel Kofi Clare và Prof. Helen Saibil, University of London
Thiết bị sử dụng cho ứng dụng này: Leica EM HPM100
A ─ Ảnh quang học chụp trên ảnh dựng lại
B ─ Ảnh hiển vi tế bào men bi kết đông
C ─ Ảnh hình thái tán xạ
Hình 1: Tế bào hình chóp. Kết nối tiếp hợp giữa chồi (P-face) và gai hình cây (E-face) của tế bào hình chóp. Akos Kulik, University of Freiburg, Germany
Hình 2: Ảnh phóng đại lớn hơn để quan thể vùi của tế bào (C), Chlamydia pneumoniae cells; (G), Glycogen granules; (Go), Golgi; (M), Mitochondrium; (Mt), Microtubules; (R), Ribosomes; (V), Vesicles. Scale bar 500 nm Kaech A, University of Zurich, Switzerland
Thiết bị sử dụng cho ứng dụng này: Leica EM HPM100
 |
 |
| Ảnh chụp mẫu nấm men bằng kỹ thuật hiển vi điện tử nhiệt độ thấp lát mỏng kết đông (CEMOVIS: cryo-electron microscopy of vitreous sections) Al-Amaudi, DZNE, Bonn | Hình 2 ─ Ảnh chụp vi khuẩn hình que với phương pháp chuẩn bị mẫu kết đông áp suất cao Dr. Carmen Lopez-Iglesias, Lidia Delagado, Elena Mercade, CC i-University Barcelona, Sciene Park |
Hình 3 ─ Ảnh chụp mẫu với phương pháp chuẩn bị mẫu kết đông áp suất cao Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center
Hình 4 ─ Ảnh chụp mẫu với phương pháp chuẩn bị mẫu kết đông áp suất cao Elena Lindeman, Fraunhofer.
