VP-SEM tích hợp bàn mẫu lạnh cho phép quan sát mẫu ẩm chứa nước với tác động gây biến dạng và co ngót tối thiểu, bên cạnh đó cũng không cần tới quá trình chuẩn bị mẫu truyền thống như cố định, khử nước, sấy khô, phủ kim loại.. Điều đó cũng giúp giảm lượng bay hơi nước và phá hủy gây ra bởi chùm tia khi quan mẫu trong khoảng thời gian dài trên kính hiển vi điện tử quét. Độ nhạy của đầu dò điện tử tán xạ ngược (BSE) đã được cải thiện đáng kể trong thời gian gần đây. Loại đầu dò này cho phép quan sát ở độ phóng đại cao kể cả trong điều kiện chân không thấp và thế gia tốc thấp, do đó rất hữu ích đối với các loại các mẫu sinh học.
Chúng tôi sử dụng đầu dò YAG BSE để quan sát vi sinh trên rau quả sạch. Rau quả sạch nhìn chung đều có vi sinh sau khi được thu hoạch. Do đó, nhà cung cấp thực phẩm phải làm sạch rau trước khi chế biến thành món rau trộn và các loại thực phẩm khác.
Tại Nhật Bản, quy định của chính phủ về hàm lượng vi sinh trên thực phẩm cho phép là từ 1 ×105 ~ 5 × 105 vi sinh trên mỗi gam hay ít hơn. Làm sạch vi sinh bằng dung dịch sodium hypochlorit có nồng độ lớn hơn 100ppm không chứa clorine không đáp ứng được yêu cầu.
Chúng tôi rửa rau sạch bằng nước điện phân axit mạnh để khử khuẩn nhanh(10,11) với thành phần chính là fumaric axit(12) được biết là có tác dụng diệt khuẩn. Chúng tôi đã quan sát những mẫu rau được làm sạch và xem xét hiệu quả làm sạch.
Chúng tôi đã dùng mẫu củ cải. Bảng 1 mô tả kỹ thuật làm sạch khi chuẩn bị mẫu. Chúng tôi đã quan sát những mẫu này ngay sau khi làm sạch mà không cần thêm công đoạn chuẩn bị mẫu nào nữa. Bảng 2 mô tả điều kiện vận hành kính hiển vi điện tử quét.
Bảng 1 Kỹ thuật làm sạch
| 1 | Chưa làm sạch |
| 2 | Làm sạch với nước máy trong vòng 1 phút |
| 3 | Nhúng trong nước điện phân axit mạnh (clo dư 40-50 ppm, độ pH2.7) trong 5 phút. Làm sạch bằng nước máy trong 1 phút. |
| 4 | Nhúng trong dung dịch chứa axit fumaric (0.3% axit fumaric, có độ pH từ 2~3) trong 5 phút. Làm sạch bằng nước máy trong 1 phút. |
Bảng 2 Điều kiện vận hành của kính hiển vi điện tử quét
| Model máy | S-3500N tích hợp đầu dò YAG BSE và bàn mẫu lạnh |
| Điện áp gia tốc | 5 kV |
| Chân không buồng mẫu | 1 Pa |
| Nhiệt độ bàn mẫu | –20°C |
Bảng số 3 cho thấy lượng vi sinh trên một phần của mẫu. Mẫu rau chưa rửa có lượng vi sinh là 10 cfu/g. Cũng mẫu đó khi rửa bằng nước máy có lượng vi sinh là 7.2 cfu/g. Rau sau khi rửa bằng nước điện phân axit mạnh với thành phần chính là axit fuaric thì chỉ có khoảng 1/100 đến 1/1000 lượng vi sinh so với mẫu chưa rửa sạch.
Bảng 3 Tác dụng làm sạch vi sinh trên mẫu củ cải
| Cách rửa | Lượng vi sinh (log của cfu/g)* |
| Chưa rửa | 7.2 |
| Rửa bằng nước máy | 6.9 |
| Rửa bằng nước axit điện hóa mạnh | 5.5 |
| Rửa bằng nước chứa axit fumaric | 4.3 |
* cfu: đơn vị cụm
Hình 1 Vi sinh trên thân của củ cải (chưa rửa)
Hình 1 cho thấy hình ảnh vi sinh trên rau sạch khi chưa được làm sạch.
Hình 1a cho thấy vùng vi sinh có độ tương phản cao hơn. Vi sinh bao phủ một vùng khá lớn. Chúng phát triển dọc theo biên ngoài tế bào.
Hình 1b và 1c là các ảnh có độ phóng đại cao hơn trên vùng có vi sinh. Ở đây, chúng ta có thể thấy nhiều loại vi sinh như vi khuẩn hình que ngắn, hình que dài, vi khuẩn hình cầu…
Hình 2 Vi sinh dính trên thân của củ cải ( rửa bằng nước máy)
Hình 2 cho thấy hình ảnh vi sinh trên mẫu rau đã được rửa bằng nước máy. Cũng như rau chưa rửa, nó có mật độ phân bố vi khuẩn dày dọc theo rãnh của biên tế bào.
Hình 3 Vi sinh vật dính trên thân của củ cải (Nhúng trong nước điện phân axit mạnh và nước máy)
Hình 4 Vi sinh dính trên than của củ cải (Nhúng trong dung dịch có thành phần chính là axit fumaric và rửa bằng nước máy)
Hình 3 và 4 cho thấy hình ảnh của mẫu rau được rửa bằng nước điện phân axit mạnh với thành phần chính là axit fumaric và nước máy. Chúng ta không còn thấy vùng vi sinh bao phủ trong các ảnh này nữa. Kết quả khả quan trong bảng số 3. Chúng ta không thấy mảng vi sinh trên phạm vi lớn xuất hiện trên các ảnh hiển vi này. Kết quả này phù hợp với thông số trên bảng 3. Khi quan sát kỹ hơn, chúng ta có thể thấy vi sinh vật xuất hiện dọc theo biên rãnh tế bào như hình 3a và 4a. Những vi sinh vật này rất khó để loại bỏ khi chúng dính hẳn vào rau chứ không chỉ nằm trên rau. Xem hình 3b và 4b.
Chúng tôi đã quan sát được vi sinh trên rau sạch được rửa bằng nhiều kỹ thuật với kính hiển vi điện tử quét (VP-SEM) có bàn mẫu lạnh và đầu dò YAG BSE. Chúng tôi đã thành công ghi lại được hình ảnh rõ nét với độ lóa tối thiểu bị tại thế gia tốc thấp. VP-SEM thích hợp cho ứng dụng quan sát nêu trên mà không yêu cần chuẩn bị mẫu.
Kính hiển vi điện tử quét (VP-SEM) cũng là công cụ thích hợp để quan sát vi khuẩn trong đất và tế bào động vật. Chúng tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của Giáo sư Shigeko Ueda và Giáo sư Yoshihiro Kuwabara, Phòng thí nghiệm sinh học, Đại học Kagawa Nutrition.
