Các máy xét nghiệm sinh hoá từ đơn giản đến hiện đại đều dựa trên nguyên tắc là phương pháp đo màu. Dung dịch cần đo được đưa vào cuvét. Một nguồn sáng có ánh sáng trắng đi qua bộ lọc để thu được một bước sóng phù hợp với dung dịch cần đo, Bộ phát hiện quang thu cường độ ánh sáng đi qua cuvét chứa dung dịch cần đo chuyển thành tín hiệu điện, từ tín hiệu điện này máy có thể tính toán và hiển thị kết quả.
Sơ đồ nguyên lý của máy xét nghiệm sinh hoá được trình bày đơn giản như sau:
1.1. Nguồn sáng
Nguồn sáng có nhiệm vụ phát ra ánh sáng trắng có cường độ đủ mạnh. Lý do dùng nguồn sáng trắng ở đây như phần cơ sở hoá sinh ta đã biết, chính là do mỗi một xét nghiệm khi phản ứng sẽ cho một màu đặc trưng của xét nghiệm đó, và nó sẽ hấp thụ mạnh nhất một dải bước sóng tương ứng, vì vậy khi đo sự hấp thụ ta chỉ dùng một bước sóng cơ bản. Với nhiều xét nghiệm ta sẽ dùng nhiều bước sóng khác nhau và nguồn sáng trắng sẽ cấp đầy đủ các bước sóng này cho tất cả các xét nghiệm.
Trong thực tế người ta có thể dễ dàng tạo ra nguồn sáng trắng. Hình 2 minh họa đầu ra của một đèn tungsten. Chúng ta thấy rằng năng lượng giảm về phía tia cực tím gần nhưng nó vẫn đủ mạnh để cấp năng lượng cho bộ phát hiện quang ở bước sóng gần 350nm. Để tăng cường độ ánh sáng đến dải vùng cực tím, người ta sử dụng một đèn halogen tungsten. Đèn này gồm một dây tóc tungsten đặt trong vỏ thạch anh chứa halogen như iốt chẳng hạn.
Đèn thuỷ ngân là một ví dụ điển hình của đèn phóng điện qua lớp khí, nó tạo ra sự phát xạ mạnh trong quang phổ màu xanh và dải cực tím.
Nhược điểm chính của đèn thuỷ ngân là nó chỉ có thể được sử dụng ở các bước sóng đặc trưng. Để khắc phục nhược điểm này, người ta sử dụng một đèn đơteri mặc dù giá thành cao và tuổi thọ tương đối ngắn. Đèn đơteri phát ra ánh sáng có bước sóng tới 190nm, dải bước sóng phù hợp với hầu hết xét nghiệm hiện nay.
1.2. Bộ lọc bước sóng
Bộ lọc bước sóng dùng để chọn lấy một bước sóng yêu cầu cho từng xét nghiệm. Sở dĩ người ta dùng nguồn sáng trắng và các bộ lọc mà không dùng các linh kiện phát ra các bước sóng cố định là do dùng bộ lọc có thể dễ dàng thêm các bộ lọc theo yêu cầu xét nghiệm tức là có tính mở đối với xét nghiệm hơn là dùng linh kiện phát ra bước sóng cố định. Trong các máy xét nghiệm sinh hoá hiện nay, bộ lọc thường là một bánh xe trên có gắn một số kính lọc , số kính lọc trên bánh xe này tuỳ thuộc vào loại máy. Các bộ lọc này là các cách tử, kính lọc, lăng kính kết hợp với các thấu kính để thu được một dải rất hẹp bước sóng: 340nm, 405nm, 505nm, 546nm, 570nm, 600nm, 650nm, 700nm…
1.3. Bộ phát hiện quang
Bộ phát hiện quang có chức năng là biến đổi tín hiệu quang thu được khi ánh sáng đi qua cuvét thành tín hiệu điện. Bộ phát hiện quang là một trong các linh kiện quang- điện đã xét ở phần trước, trên thực tế hiện nay thường dùng là photo điốt hay photo tranzito do kích thước nhỏ, thích hợp cho các máy xách tay hoặc những máy có cấu trúc nhỏ. Đồng thời lại có độ nhạy cao hơn các linh kiện khác.
1.4. Hiển thị
Kết quả đo sẽ được hiển thị trên khối hiển thị. Tuỳ từng loại máy mà có các cách hiển thị kết quả khác nhau, có thể chỉ đơn giản là hiển thị dưới dạng số trên led 7 thanh, hiển thị trên màn hình CRT hoặc là hiển thị trên màn hình tinh thể lỏng (LCD). Từ đó, kết quả hiển thị có thể ở mức đơn giản là cường độ dòng điện thu được, hoặc được tính toán để hiển thị chi tiết đến độ hấp thụ, nồng độ chất, tên bệnh nhân, số thứ tự, ngày tháng xét nghiệm…
2.1. Phương pháp điểm cuối (Endpoint)
Phương pháp này chỉ đo độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng một lần, đó là lúc phản ứng tạo màu đã sảy ra hoàn toàn, và nồng độ các chất trong dung dịch sau phản ứng đã ổn định. Có thể đo độ hấp thụ ở một bước sóng (monochromatic) hoặc hai bước sóng (bichromatic). Sử dụng dung dịch chuẩn (Standard) để dựng đường chuẩn hay hệ số cài đặt trước.
Chia theo số dung dịch chuẩn sử dụng khi đo ta có 3 loại:
– Phép đo chỉ sử dụng một dung dịch chuẩn: nồng độ của mẫu cũng được tính theo công thức:
– Phép đo sử dụng nhiều dung dịch chuẩn (multistandard): nồng độ của mẫu được xác định từ đường cong chuẩn. Đường cong này dựng được từ các dung dịch chuẩn đã biết trước nồng độ và độ hấp thụ đo được:
(Astandard– Ablank).TR
TR là chiều của phản ứng : +1 nếu chiều phản ứng tăng
-1 nếu chiều phản ứng giảm
Nồng độ của mẫu được nội suy từ đường cong chuẩn: (Asample– Ablank).TR
– Phép đo sử dụng hệ số:
Khi đo không sử dụng các dung dịch chuẩn mà sử dụng một hệ số cho trước để tính ra nồng độ của dung dịch. Nồng độ mẫu được tính theo công thức:
Csample = (Asample– Ablank).F
Với F là hệ số cho trước
Chia theo số bước sóng sử dụng khi đo ta có 2 loại:
– Phép đo một bước sóng: đo độ hấp thụ của dung dịch Trắng, Chuẩn và Mẫu tại một bước sóng.
– Phép đo hai bước sóng: đo độ hấp thụ của Trắng (Blank), Chuẩn và mẫu (Sample) tại hai bước sóng, một bước sóng chính và một bước sóng phụ, độ hấp thụ của các dung dịch được tính theo công thức sau:
Asample, Astandard, Ablank=Almain– Alref
A: độ hấp thụ
lmain: Bước sóng chính
lref: Bước sóng phụ
2.2. Phương pháp động học (Kinetic)
Phương pháp động học được sử dụng để đo độ hoạt động của enzym. Đặc điểm của phương pháp này là đo ngay khi bắt đầu phản ứng, sau một khoảng thời gian trễ (Delay time) nào đó, không có thời gian đợi phản ứng ổn định.
– Phương pháp đo động học (K):
Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo n lần trong thời gian phản ứng t (Reaction time), khoảng cách giữa n lần đo là t/n giây và tính giá trị chênh lệch của các độ hấp thụ giữa phép đo sau với phép đo trước, kết quả cuối cùng là tính được giá trị chênh lệch trung bình/phút (DA/min)
Độ hoạt động của enzym được tính theo công thức:
Độ hoạt động của Enzym =DA/min.K.
Trong đó, K là hệ số thường được cho trước với từng loại hoá chất.
Đơn vị đo độ hoạt động enzym là U/L, ngoài ra còn sử dụng đơn vị mới là kat (katal) là lượng men xúc tác sự biến đổi 1 mol cơ chất trong 1 giây.
– Phương pháp đo thời gian cố định (Fixed Time):
Cũng tương tự như phép đo động học, nhưng chỉ khác là thời gian giữa các lần đo độ hấp thụ là cố định.
